網(wǎng)站首頁
外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)表達(dá)，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達(dá)到高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天；一類是穩(wěn)定表達(dá)（構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株），外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可長期表達(dá)目的基因。
建立穩(wěn)定細(xì)胞株，基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選，得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。
示例：MSLN過表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建
1. 過表達(dá)人MSLN蛋白(Q13421)的慢病毒載體構(gòu)建，其結(jié)構(gòu)圖如圖 1所示：
Fig.1 MSLN慢病毒載體圖譜
2. 將制備的慢病毒載體及慢病毒包裝質(zhì)粒PspaX2、PMD2 .0G轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝72小時(shí)后回收病毒；
3. 檢測病毒滴度，以三種不同的滴度感染CHO-K1宿主細(xì)胞，24小時(shí)后更換培養(yǎng)基；
4. 以未感染慢病毒的CHO-K1細(xì)胞（以下稱為CHO-K1-blank）為陰性對(duì)照組，以感染慢病毒的CHO-K1細(xì)胞（以下稱為CHO-K1-MSLN）cell pool為實(shí)驗(yàn)組，各組加入不同的藥物濃度加壓篩選，選取適當(dāng)?shù)乃幬餄舛群髷U(kuò)大培養(yǎng)4-5代。
5. 以梯度稀釋法在96孔板中培養(yǎng)CHO-K1-MSLN細(xì)胞，5天后觀察細(xì)胞生長并挑選單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
6. 取2E5擴(kuò)大培養(yǎng)的單克隆細(xì)胞，F(xiàn)ACS buffer洗兩遍后加入陽性檢測抗體(220812A01)[1]，如下圖所示，流式細(xì)胞術(shù)檢測MSLN蛋白的表達(dá)。
流式檢測MSLN表達(dá)
費(fèi)洛斯的慢病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株平臺(tái)基于載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選，常用的真核表達(dá)載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株，為基礎(chǔ)研究（基因功能研究）、藥物篩選（CAR開發(fā)前期scFv篩選）等提供科研助力。
[1]. Yuchun Gu, Le Yin. A kind of CAR-NK cell preparation method of target mesothelin[P].China.
[2].CN109762844A.2019.05.17